在生命科學與醫學研究領域，精確檢測生物分子的含量和活性是探索生命奧秘、攻克疾病難題的關鍵環節。博清生物科技（南京）有限公司研發生產的酶標儀作為一種能夠快速、高效測定微孔板中吸光度或熒光強度的儀器，在眾多科研實驗中發揮著不可或缺的作用。本實驗以檢測血清中某腫瘤標志物含量為例，詳細介紹酶標儀在科研實驗中的具體應用過程。
一、實驗目的
利用酶聯免疫吸附測定（ELISA）技術結合酶標儀，準確測定不同患者血清樣本中腫瘤標志物甲胎蛋白（AFP）的含量，通過分析其含量差異，為腫瘤的早期診斷、病情監測及預后評估提供數據支持，并驗證酶標儀在該類檢測實驗中的準確性和可靠性。
二、實驗設計
（一） 實驗材料
1、樣本：收集30份臨床患者血清樣本，其中包括10份確診肝癌患者血清10份肝硬化患者血清以及10份健康人血清，所有樣本均經過倫理審查并獲得患者知情同意，采集后置于-80℃冰箱保存備用。
2、試劑：AFP ELISA檢測試劑盒（包含預包被AFP抗體的微孔板、AFP標準品、生物素標記的檢測抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標記的鏈霉親和素、底物顯色液、終止液、洗滌緩沖液等）、磷酸鹽緩沖液（PBS）。
3、儀器：酶標儀（具備450nm波長檢測功能）、恒溫培養箱、微量移液器及配套吸頭、振蕩器、離心機。
（二）樣本分組與處理
將30份血清樣本按照疾病類型分為肝癌組、肝硬化組和健康對照組，每組10個樣本。實驗前將血清樣本從-80℃冰箱取出，置于室溫下緩慢解凍，輕輕顛倒混勻后，以3000rpm離心10分鐘，取上清液用于后續檢測，避免樣本中雜質影響檢測結果。
三、實驗操作步驟
（一） 準備工作
1、從冰箱中取出AFP ELISA 檢測試劑盒，平衡至室溫（約30分鐘），同時將洗滌緩沖液用蒸餾水按1:20比例稀釋備用。
2、根據實驗需求，將所需的微孔板條放入微孔板框架中，剩余的板條密封后放回試劑盒中，置于4℃保存。
（二） 加樣
1、標準品稀釋：在1.5ml離心管中，將AFP標準品按照試劑盒說明書進行倍比稀釋，制備濃度依次為0ng/mL（空白對照）、5ng/mL、25ng/mL、125ng/mL、625ng/mL、3125ng/mL的標準品溶液。
2、加樣：分別取50μl不同濃度的標準品溶液加入對應的微孔中，每個濃度設置3個復孔；然后取50μl血清樣本加入相應的微孔，同樣每個樣本設置3個復孔。加樣時，移液器吸頭應垂直懸空于微孔上方，避免吸頭觸碰孔壁，防止樣本交叉污染。
（三） 溫育與洗滌
1、加樣完成后，在每孔中加入50μl生物素標記的檢測抗體，輕輕振蕩微孔板使溶液混合均勻，用封板膜密封微孔板，置于37℃恒溫培養箱中溫育60分鐘，使抗體與抗原充分結合。
2、溫育結束后，棄去孔內液體，每孔加入350μl洗滌緩沖液，靜置30秒后甩干，重復洗滌5次，以徹底去除未結合的物質，減少背景干擾。洗滌過程中，可使用振蕩器輔助，確保洗滌充分。
（四） 顯色與終止反應
1、每孔加入100μlHRP標記的鏈霉親和素，輕輕振蕩混勻，再次用封板膜密封，37℃溫育30分鐘。
2、溫育結束后，重復上述洗滌步驟5次。
3、每孔加入100μl底物顯色液，輕輕振蕩后，室溫避光顯色15-20分鐘，觀察到標準品孔出現明顯顏色變化。
4、每孔加入50μl終止液，終止顯色反應，此時溶液顏色由藍色變為黃色。
（五）酶標儀檢測
將微孔板放入酶標儀中，設置檢測波長為450nm，測定各孔的吸光度（OD值）。在檢測前，確保酶標儀預熱至穩定狀態，并按照儀器操作手冊進行校準，以保證檢測結果的準確性。
四、實驗結果分析
（一）原始數據整理
記錄酶標儀檢測得到的各標準品孔和樣本孔的OD值，剔除明顯異常的OD值（如因加樣失誤、孔內有氣泡等導致的數據），計算每個標準品濃度和樣本的OD值平均值。
（二）標準曲線繪制
以AFP標準品濃度為橫坐標，對應的OD值平均值為縱坐標，使用GraphPad Prism或Excel軟件繪制標準曲線。選擇合適的曲線擬合方式（如四參數邏輯回歸模型），得到標準曲線的回歸方程，確保標準曲線的相關系數（R2）大于0.99，以保證曲線的可靠性。
（三）樣本濃度計算
將樣本的OD值平均值代入標準曲線回歸方程，計算出各血清樣本中AFP的濃度。同時，計算每組樣本（肝癌組、肝硬化組、健康對照組）AFP濃度的平均值、標準差和置信區間。
（四）統計學分析
采用單因素方差分析（One-way ANOVA）比較三組樣本AFP濃度的差異，若差異具有統計學意義（P<0.05），進一步使用Tukey多重比較法進行組間兩兩比較，明確不同組之間的具體差異。
（五） 結果呈現
1、以表格形式展示各標準品濃度、對應的OD值平均值以及樣本的AFP濃度計算結果。
2、繪制柱狀圖直觀呈現三組樣本AFP濃度的平均值和標準差，清晰展示不同組之間AFP含量的差異。
3、結合統計學分析結果，撰寫結果分析報告，闡述實驗數據所反映的生物學意義，如肝癌患者血清中AFP濃度顯著高于肝硬化患者和健康人，驗證AFP作為腫瘤標志物在肝癌診斷中的應用價值。
五、實驗結論
本實驗成功運用酶標儀結合ELISA技術完成了血清中腫瘤標志物AFP含量的檢測。實驗結果表明，博清生物科技（南京）有限公司研發生產的酶標儀能夠準確測定微孔板中樣本的吸光度，通過標準曲線計算得到的樣本AFP濃度具有較高的可靠性。不同疾病組患者血清中AFP含量存在顯著差異，與臨床認知相符，進一步驗證了AFP在腫瘤診斷中的重要作用。同時，本實驗的操作流程和數據分析方法為其他基于酶標儀的免疫檢測實驗提供了參考范例，有助于推動相關科研和臨床檢測工作的開展。在未來的研究中，可進一步擴大樣本量，深入探究AFP含量與腫瘤分期、預后等因素的關系，為腫瘤的精準診療提供更豐富的依據。
